PCR(Polymerase chain reaction) 중합효소 연쇄반응

• 중합효소 연쇄반응 과정

(1) DNA denaturation (2) Annealing(primer의 결합) (3) Extension (DNA 합성)

-DNA Denaturation : 자연상태에서 두 가닥으로(double strand) 되어 있는 DNA를 고온(95℃)에서 한 가닥으로 분리(변성)

-변성된 단량체(single-tranded)의 DNA를 낮은 온도(50~60℃)에서 Primer(1)와 결합

-72~75℃에서 Polymerase(2)가 Primer로부터 DNA를 합성하는 세 단계를 반복적으로 시행함으로써 증폭된 DNA를 얻어 분석하는 방법

(1)DNA 복제가 일어날 때 상보적인 염기 서열이 새로 만들어지는 시작이 되는 짧은 조각. 

(2)단량체를 결합시켜서 중합체를 형성하는 효소.

 

• PCR 공정

- DNA 변성(Denaturation), 결합(Annealing) 및 신장(Extension) 단계로 이루어진다.

1. DNA변성 (Denaturation) : 이중 나선 구조의 DNA를 95℃에서 15~30초간 열처리하여 한 가닥의 DNA로 분리시킨다.

 2. 결합(Annealing) : 열처리 후 온도를 낮추면 2종류의 primer가 변성된 한 가닥의 DNA 상보적인 부분에 결합 한다.

Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 Annealing 한다.

3. 신장(Extension) : 4종류의 기질(dNTP)(3) 이 공존하는 상태에서 DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭 단편의 크기, 반응온도 등에 따라 좌우되지만 일반적으로 Thermus aquaticus(Taq)(4) Polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30초~10분간(증폭크기 약 10kbp) 처리한다. Taq Polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)를 고려하여 시간을 설정한다.

 

(3) dATP + dGTP + dCTP + dTTP (+ dUTP) = dNTP, DNA 합성 과정에 블록으로 쓰일 수 있는 디옥시(d) 3인산 형태(xTP)의 AGCT 혼합 (2번째 탄소에 OH가 있으면 NTP, H가 있으면 dNTP, d:deoxy)

(4) 섭씨 55 ℃ 이상의 고온에서 서식하는 호열성 세균으로 생장 최적 조건은 70-75 ℃(주변환경 55~100 ℃), pH 7.5-8.

Thermus aquaticus Y51MC23 (출처: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138674)

PCR_Gene Channels

참고 : Roche - Light Cycler

참고 : BIO-RAD LABORATORIES INC

참고 : Rotor-Gene Q.

Dyes commonly used for quantitative, real-time PCR

https://www.qiagen.com/us/service-and-support/learning-hub/molecular-biology-methods/pcr/ 발췌 및 부부 수정